凝胶迁移（EMSA）的转膜和紫外交联步骤

作者：上海峰志时间：2022-10-28 22:08:56浏览2081 次

信息摘要：

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

EMSA技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。首先让蛋白质与末端标记的核酸探针结合，然后在跑PAGE胶，结合了蛋白质的复合物比未结合蛋白质的探针电泳的速度要慢，这样，从PAGE胶的电泳结果就可以判断，该蛋白是否和特定序列结合或者该序列是否和蛋白结合。

EMSA转膜的步骤：

a. 取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。

b. 取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿。

c. 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。

d. 非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。

e. 再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。

f. 采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4C冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。

g. 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。

紫外交联的步骤：

a. 用紫外交联仪(UV crosslinker UCL-3500)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联25-60秒(根据经验，建议交联30秒)。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如美国路阳的手提紫外检测仪LEC-280)，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。

b. 紫外交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。

c. 如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联一次，以进一步改善交联效果。