PMA光解仪在活菌检测中的应用

PMA光解仪在活菌检测中的应用 

PMA是一种高亲和性的DNA结合染料，尤其与双链DNA，该染料本身具有微弱的荧光，但与核酸结合后可以发出更为明亮的荧光。PMA具有细胞膜不可渗透性，因此可选择性地修饰膜受损的死细胞的DNA。PMA修饰的DNA经LUYOR-3419PMA光解仪蓝光（~464 nm）光解后，PMA上的光反应性叠氮基转化为高反应性氮烯自由基，与DNA结合位点附近的任何烃部分反应形成稳定的共价氮碳键，从而导致性DNA 修饰。该修饰过程会使DNA不溶，且在后期的基因组DNA提取过程中与细胞碎片一起丢失。残留在溶液中未结合的PMA，在强光照射下与水分子反应分解成无交联活性的羟胺化合物，使其不能再共价结合DNA。基于PMA的这一特性，我司将PMA与qPCR技术相结合，形成一种新的检测方法—PMA-qPCR，用于活细菌的筛选。目前该法已在多种细菌菌株以及酵母、真菌、病毒和寄生虫中得到验证。

复杂样品的处理，如粪便或土壤，可能会需要优化样品稀释度、染料浓度和光处理时间。稀释样品的处理，如水测试，可能需要在染料处理前进行过滤或浓缩。

叠氮溴化丙锭的介绍 

叠氮溴化丙锭( PMA)是一种光敏反应染料，它对DNA具有非常高的亲和力。当细胞膜处于不完整状态或者细胞已经死亡，细胞膜对外界的物质的进出就没有了选择性，PMA就可以顺利进入细胞内，与DNA进行结合，在LUYOR-3419PMA光解仪光照作用下发生交联反应。交联后的DNA就不能作为模板进行扩增，残留在溶液中的未被结合的PMA在光照下与水分子形成羟胺化合物，从而阻止其与在提取过程中活菌产生的DNA结合，影响检测结果。而对于活的细胞而言，细胞膜具有选择性，PMA便不能进入细胞内与DNA进行交联反应。将PMA这种特性与荧光定量PCR技术进行偶联，便可以实现对活菌的检测。 

影响活菌检测的因素 

采集的样品 

PMA偶联荧光PCR技术对样品的要求比较高。有研究发现，环境中的样品，食品样品和临床上的病料中常常含有一些无机物质．有机物质。这些物质的存在既可以降低PMA的有效浓度，也可以干扰PMA与核酸的交联反应。详细的说，样品中的无机物和有机物会造成样品的浊度提高，样品越浑浊，光的透过性就越差，越影响PMA与样品在光照条件下的交联反应。为了避免和减少因样品采集带来的误差，Luo等人在一项研究中提出，要严格规范浊度的阈值，这样对每一份样品检测具有更重要的意义和参考价值。有研究表明，当样品的浊度达到10个散射浊度单位的时候，样品的浊度对于PMA交联DNA是没有影响的。当样品的浊度高于10个散射浊度时，样品的浊度对于PMA交联DNA具有非常大的影响。 

PMA与DNA作用阶段 

PMA与DNA作用阶段主要是指PMA进入细胞膜受损伤的过程和PMA结合DNA的过程。PMA是一种对光较为敏感的染料，即便在普通光源下，也能降低PMA的有效浓度。因此，在PMA与细胞核DNA作用的过程中要避光。在这个过程中，PMA的浓度、PMA与核酸的作用时间，温度等都会影响终的检测结果。有些学者在参考别的研究者活菌检测技术时，设置了同样的温度、浓度和时间，但是结果却不甚理想。其主要原因是样品不同，佳的PMA的浓度和作用时间也会有很大的差异。如较低浓度时，PMA是不能够完全结合掉的死菌DNA，那么部分没有结合的死菌的DNA便可以作为模板被扩增出来，从而造成活菌检测数据不准确。如果PMA的浓度过高，PMA也可以渗入到活的细胞中，将部分活的细胞DNA结合掉，造成检测结果的不准确。因此，无论是做哪一项活菌检测，PMA的浓度和作用时间等参数要先优化，后使用。PMA进入细胞的效率和有效结合DNA的效率还与温度有关。有研究表明。在室温的条件下，PMA结合DNA的效率高。另外，PMA与细胞的作用时间也要考虑到位。作用时间过长，PMA也能够渗透到活细胞中，造成结果的不准确。