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PMA光解仪在活菌检测中的应用

作者:上海峰志 时间:2022-12-30 13:19:15浏览879 次

信息摘要:

PMA是一种光敏反应染料,它对DNA具有非常高的亲和力。当细胞膜处于不完整状态或者细胞已经死亡,细胞膜对外界的物质的进出就没有了选择性,PMA就可以顺利进入细胞内,与DNA进行结合,在光照作用下发生交联反应。

PMA光解仪在活菌检测中的应用 

PMA是一种高亲和性的DNA结合染料,尤其与双链DNA,该染料本身具有微弱的荧光,但与核酸结合后可以发出更为明亮的荧光。PMA具有细胞膜不可渗透性,因此可选择性地修饰膜受损的死细胞的DNA。PMA修饰的DNA经LUYOR-3419PMA光解仪蓝光(~464 nm)光解后,PMA上的光反应性叠氮基转化为高反应性氮烯自由基,与DNA结合位点附近的任何烃部分反应形成稳定的共价氮碳键,从而导致性DNA 修饰。该修饰过程会使DNA不溶,且在后期的基因组DNA提取过程中与细胞碎片一起丢失。残留在溶液中未结合的PMA,在强光照射下与水分子反应分解成无交联活性的羟胺化合物,使其不能再共价结合DNA。基于PMA的这一特性,我司将PMA与qPCR技术相结合,形成一种新的检测方法—PMA-qPCR,用于活细菌的筛选。目前该法已在多种细菌菌株以及酵母、真菌、病毒和寄生虫中得到验证。

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复杂样品的处理,如粪便或土壤,可能会需要优化样品稀释度、染料浓度和光处理时间。稀释样品的处理,如水测试,可能需要在染料处理前进行过滤或浓缩。

叠氮溴化丙锭的介绍 

叠氮溴化丙锭( PMA)是一种光敏反应染料,它对DNA具有非常高的亲和力。当细胞膜处于不完整状态或者细胞已经死亡,细胞膜对外界的物质的进出就没有了选择性,PMA就可以顺利进入细胞内,与DNA进行结合,在LUYOR-3419PMA光解仪光照作用下发生交联反应。交联后的DNA就不能作为模板进行扩增,残留在溶液中的未被结合的PMA在光照下与水分子形成羟胺化合物,从而阻止其与在提取过程中活菌产生的DNA结合,影响检测结果。而对于活的细胞而言,细胞膜具有选择性,PMA便不能进入细胞内与DNA进行交联反应。将PMA这种特性与荧光定量PCR技术进行偶联,便可以实现对活菌的检测。 

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影响活菌检测的因素 

采集的样品 

PMA偶联荧光PCR技术对样品的要求比较高。有研究发现,环境中的样品,食品样品和临床上的病料中常常含有一些无机物质.有机物质。这些物质的存在既可以降低PMA的有效浓度,也可以干扰PMA与核酸的交联反应。详细的说,样品中的无机物和有机物会造成样品的浊度提高,样品越浑浊,光的透过性就越差,越影响PMA与样品在光照条件下的交联反应。为了避免和减少因样品采集带来的误差,Luo等人在一项研究中提出,要严格规范浊度的阈值,这样对每一份样品检测具有更重要的意义和参考价值。有研究表明,当样品的浊度达到10个散射浊度单位的时候,样品的浊度对于PMA交联DNA是没有影响的。当样品的浊度高于10个散射浊度时,样品的浊度对于PMA交联DNA具有非常大的影响。 

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PMA与DNA作用阶段 

PMA与DNA作用阶段主要是指PMA进入细胞膜受损伤的过程和PMA结合DNA的过程。PMA是一种对光较为敏感的染料,即便在普通光源下,也能降低PMA的有效浓度。因此,在PMA与细胞核DNA作用的过程中要避光。在这个过程中,PMA的浓度、PMA与核酸的作用时间,温度等都会影响终的检测结果。有些学者在参考别的研究者活菌检测技术时,设置了同样的温度、浓度和时间,但是结果却不甚理想。其主要原因是样品不同,佳的PMA的浓度和作用时间也会有很大的差异。如较低浓度时,PMA是不能够完全结合掉的死菌DNA,那么部分没有结合的死菌的DNA便可以作为模板被扩增出来,从而造成活菌检测数据不准确。如果PMA的浓度过高,PMA也可以渗入到活的细胞中,将部分活的细胞DNA结合掉,造成检测结果的不准确。因此,无论是做哪一项活菌检测,PMA的浓度和作用时间等参数要先优化,后使用。PMA进入细胞的效率和有效结合DNA的效率还与温度有关。有研究表明。在室温的条件下,PMA结合DNA的效率高。另外,PMA与细胞的作用时间也要考虑到位。作用时间过长,PMA也能够渗透到活细胞中,造成结果的不准确。

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