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分子杂交技术的原理和分子杂交炉的选用

作者:上海峰志仪器 时间:2021-08-03 09:35:22浏览173 次

信息摘要:

分子杂交指具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA分子或RNA),在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理,形成异质双链的过程。利用这一原理,就可以使用已知序列的单链核酸片段作为分子探针,去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。

分子杂交技术的原理

分子杂交指具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA分子或RNA),在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理,形成异质双链的过程。利用这一原理,就可以使用已知序列的单链核酸片段作为分子探针,去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。

DNA分子变性:
DNA分子变性是指双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成单链无规则线团,因而发生性质改变(如粘度下降,沉降速度增加,浮力上升,紫外吸收增加等)。
1、DNA分子变性的方法:①加热;②改变DNA分子溶液的pH;③有机溶剂(如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素。
2、增色效应:DNA分子在260nm处有zui大吸收值,这一特征是由于含有碱基的缘故。在DNA分子双螺旋结构模型中碱基藏于内侧,变性时由于双螺旋解开,于是碱基外露,260nm紫外吸收值因而增加,这一现象称为增色效应。利用DNA分子变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。
3、溶解曲线:如果升高温度使DNA分子变性,以温度对紫外吸收作图,可得到一条曲线,称为溶解曲线。
4、融解温度:通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度(即熔解曲线中点对应的温度),由于这一现象和结晶的融解相类似,故又称融点或融解温度。因此Tm是指消光值上升到zui大消光值一半时的温度。
5、影响Tm值的因素:Tm不是一个固定的数值,它与很多因素有关:
①外部因素:pH、离子强度。随着溶剂内离子强度上升,Tm值也随着增大。
②内部因素:DNA分子的碱基比例、DNA分子的均一性;在相同条件下,DNA分子内G-C配对含量高,其Tm值也高。

DNA分子复性:
变性DNA分子只要消除变性条件,二条互补链还可以重新结合,恢复原来的双螺旋结构,这一过程称为复性。
退火:通常DNA分子热变性后,将温度缓慢冷却,并维持在比Tm低25~30℃左右时,变性后的单链DNA分子即可恢复双螺旋结构,因此,这一过程又叫做退火。
复性后的DNA分子,理化性质都能得到恢复。倘若DNA分子热变后快速冷却,则不能复性。
影响复性速度的因素:
1、DNA分子浓度:愈高,复性速度也愈快。
2、DNA分子片段的大小:DNA分子片段愈大,扩散速度愈低,使DNA分子片段线状单链互相发现互补的机会减少。因此,在复性实验中,有时将DNA分子切成小片段,再进行复性。
3、温度:过高不利于复性。
4、溶液的离子强度:通常盐浓度较高时,复性速度较快。
5、DNA分子顺序的复杂性;简单的分子复性很快,如polyd和polyd由于彼此互补识别很快,故能迅速复性。但顺序较复杂的DNA分子复性则较慢。因此通过变性速率的研究,可以了解DNA分子顺序的复杂性。iStock-DNA-sequence.jpg


分子杂交技术有哪些

分子杂交技术主要有三种:核酸分子杂交、聚合酶链反应和生物芯片技术。
1、核酸分子杂交技术具有一定互补序列和核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程,称为核酸分子杂交。杂交的双方是待测核酸序列和探针序列。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。
2、聚合酶链反应(即Polymerase chain reaction,PCR) 原理:PCR是模板DNA,引物和四种脱氧核糖核昔三磷酸(dNTP)在DNA聚合酶作用下发生酶促聚合反应,扩增出所需目的DNA。包括三个基本步骤:双链DNA模板加热变性成单链(变性);在低温下引物与单链DNA互补配对(退火);在适宜温度下TapDNA聚合酶催化引物沿着模板DNA延伸。
3、生物芯片技术是近年发展起来的分子生物学与微电子技术相结合的核酸分析检测技术。zui初的生物芯片技术主要目标是用于DNA序列测定、基因表达谱鉴定和基因突变体检测和分析,所以又称为DNA芯片或基因芯片技术。由于目前这一技术已扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域,出现了蛋白质芯片、免疫芯片、细胞芯片、组织芯片等,所以改称生物芯片技术更符合发展趋势。

分子杂交技术可按作用环境大致分为:液相杂交和固相杂交两种类型。
1、液相杂交,液相杂交指所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相杂交是一种研究zui早且操作复合的杂交类型,在过去的30年里虽有时被应用,但总不如固相杂交那样普遍。其主要原因是杂交后过量的未杂交分子探针在溶液中除去较为困难和误差较高。
2、固相杂交,固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上,另一条核酸链游离在溶液中。由于固相杂交后,未杂交的游离片段可容易地漂洗除去,膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA分子自我复性等优点,故该法zui为常用。根据支持物的不同固相杂交又可为:滤膜杂交、菌落分子原位杂交和组织分子原位杂交。

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分子杂交技术的应用

1、核酸探针标记编辑
核酸探针根据核酸的性质,可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法
2、双链DNA探针标记法编辑
分子生物研究中,zui常用的探针即为双链DNA探针,它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
3、单链DNA探针编辑
用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:
(1) 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针;
(2) 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针。
4、寡核苷酸探针编辑
利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对,可以准确地设计杂交条件,以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交,对于一些未知序列的目的片段则无效。

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分子杂交仪分类

分子杂交仪结构和分类,上海峰志主要销售美国UVP公司生产的HB-1000分子杂交箱
分子杂交仪又被叫做分子杂交箱或者分子杂交炉,是通过核酸分子杂交技术对是否有已知基因序列存在于待测基因组中进行检测的设备。其在遗传病的基因诊断、基因组中特定基因序列的检测、酶切图谱的制作和克隆基因的筛选等方面得到广泛地应用。

结构
电脑控制系统、隔膜、杂交管、摇床、离心管转架或杂交瓶转架以及箱体共同构成分子杂交仪,由于分子杂交仪的型号差异,其箱体所容纳的平板数、载玻片数微孔版数、管子数也不一样。

分类
根据自动化程度,分子杂交仪包括全自动分子杂交仪、半自动分子杂交仪和普通分子杂交仪。
1.全自动分子杂交仪
目前,全自动分子杂交仪在基因芯片产品方面被使用,其能够使杂交过程不需要人工参与,使整个杂交过程的自动化得以实现。在特定温度条件下,基因组DNA与芯片上特异的DNA探针发生反应,然后进行杂交、洗膜、孵育、显色等,从而使检测结果获得,全自动分子杂交仪自动完成上述所有过程。
2.半自动分子杂交仪
半自动分子杂交仪不但可以控制杂交过程中的各种参数,而且还可以在人工参与下完成杂交后的如孵育、显色等其他实验步骤。
3.普通分子杂交仪
普通分子杂交仪结构通常为封闭式恒温箱式,此外加上振荡或旋转式可动机构,温度控制、转速等实验参数的控制和调整由控制系统来实现。

按照实验的需求,可以将分子杂交仪以下6类:
1. 微孔板原位杂交仪。
2. 载玻片原位杂交和平板杂交仪。
3.Western杂交仪。
4.用于大容量的分子杂交仪。
5.用于 Southern或者 Northern技术点杂交的杂交仪。
6. 用于小容量的核酸杂交仪。
7. 微孔板原位杂交仪。

 

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