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CRISPR/CAS是什么?

作者:上海峰志仪器 时间:2021-07-28 13:19:45浏览146 次

信息摘要:

CRISPR代表"Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"(成簇规律间隔短回文重复序列)。II型原核生物CRISPR“免疫系统”的发现,使得能够开发简单、易用、快速实施的RNA指导的基因组编辑工具。CRISPR首字母缩写通常发音为“ crisper”。

CRISPR/CAS是什么?


CRISPR代表"Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"(成簇规律间隔短回文重复序列)。II型原核生物CRISPR“免疫系统”的发现,使得能够开发简单、易用、快速实施的RNA指导的基因组编辑工具。CRISPR首字母缩写通常发音为“ crisper”。


CRISPR / CAS采用何种工作原理?

CRISPR通路在细菌中被发现,其功能很像免疫系统,可以抵御入侵的病毒和质粒DNA。来自入侵病毒的短DNA序列(间隔区)掺入细菌基因组内的CRISPR基因位点,并充当先前感染的“记忆”。再感染引发互补的成熟CRISPR RNA(crRNA)以找到匹配序列 — 其为CRISPR相关(Cas)核酸酶提供特异性,以在特定 “外源” DNA序列处形成双链断裂。

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图 1.基因组靶标位点
CRISPR CAS9采用何种工作原理?
为了创建这样的工具,内源CRISPR途径被简化为两个主要组分:Cas9核酸酶和指导RNA(gRNA)1-7。导向RNA是由crRNA和tracrRNA组成的双组分系统。crRNA靶向待切割的双链DNA,并且具有短的同源区域,允许其结合tracrRNA。 tracrRNA提供与Cas9蛋白结合的茎环结构。crRNA:tracrRNA双链体被称为gRNA。 Cas9核酸酶和gRNA形成Cas9核糖核蛋白(RNP),可以在整个基因组环境中结合并切割特定的DNA靶标。为了被RNP切割,靶必须具有两个特定序列。首先,gRNA需要17-21个碱基的RNA至DNA同源性,这被称为前间隔序列。 其次,Cas9蛋白需要有一个短的前间隔序列邻近基序(PAM),以结合靶DNA(参见图2)。 如果存在连接tracrRNA,并且在gRNA和基因组靶标之间存在足够的同源性,则RNP切割靶DNA的两条链,在基因组中的该位置处产生DSB。

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图 2.CRISPR / Cas靶向双链断裂的示意图。

虽然细胞核中的功能性CRISPR是RNP形式,但作为分子工具的CRISPR的组件适合于各种递送方法。 早期实验成功地创建了嵌合单指导RNA或sgRNA,其将crRNA和tracrRNA组合成单个RNA链而不是天然存在的双链体。 该sgRNA和Cas9 mRNA可以从单个质粒表达,用于直接转染或包装成用于慢病毒转导的颗粒。 也可将重组Cas9蛋白与合成产生的crRNA和tracrRNA组合,以生成RNP转染或显微注射给胚胎。

靶向DSB形成后,细胞通常使用两种DNA修复途径中的一种来存活:非同源末端连接(NHEJ)或同源依赖性修复(HDR)。这些修复机制经常会出错,导致在靶位置诱变,或者通过破坏编码序列来功能性地失活或敲除基因(NHEJ),或者通过添加新的DNA序列来敲入特定的序列变化(HDR)。通过这种方式,CRISPR / Cas9系统能够对染色体DNA进行的、可遗传的修饰。此外,当Cas9核酸内切酶结构域失活并附着于其他效应分子以作用于基因组中的gRNA指定位点时,CRISPR系统可用作靶向递送系统。 这将CRISPR系统功能扩展到基因激活和抑制。zui后,CRISPR系统可用于筛选。CRISPR / Cas9系统的基因敲除、基因敲入、基因激活或抑制、以及筛选这所有四种主要用途将在下面进一步讨论。


基因敲除

当与靶向基因特异的gRNA一起共表达时,CRISPR / Cas9产生敲除细胞或动物模型。基因敲除的目的是通过破坏其在细胞中的表达来揭示基因功能。共表达的适当设计的gRNA指导Cas9切割靶序列,并在目的基因中产生DSB。然后可以通过三种方式中的任何一种实现基因敲除:1)细胞通过NHEJ修复断裂,导致切割基因的开放阅读框(ORF)内的随机插入或缺失(“插入缺失”);2)细胞通过HDR从用户提供的模板修复断裂,将特定的破坏性序列插入ORF中;3)一对gRNA产生两个DSB,其位于基本编码序列的侧翼,导致其切除。

NHEJ是zui活跃的修复机制,但是容易出错,并且经常引入移码,导致过早终止密码子和/或导致所得转录物成为无义介导的衰变(NMD)的靶标。移码修饰可导致过早终止密码子被引入转录物,阻止氨基酸链的关键部分被翻译,导致异常短的无功能蛋白质。无义介导的衰变通过消除含有过早终止密码子的mRNA转录物来减少基因表达中的错误。 理论上,当外显子-外显子连接复合物(也就是RNA剪接期间在外显子之间的前mRNA链上形成的蛋白质复合物)在转录物被剪接后未被核糖体适当地去除时,这个监视途径被激活。当外显子-外显子连接复合物由于上游移码而保持结合时,转录物被指示降解,并且功能蛋白质从未被翻译。这两种途径都有效破坏细胞中的基因功能。

基因敲入

CRISPR / Cas9也可用于引入或“敲入”新的DNA序列。常见的修饰包括引入单核苷酸多态性(SNP)、小标签、loxP或更大的基因盒,例如荧光蛋白。这些修饰是通过特定位置的Cas9诱导的DSB进行的,这显著增强了靶向整合的机会。靶向整合(基因敲入)通过HDR发生。为了通过HDR进行基因编辑,必须将含有所需序列的DNA “供体” 或修复模板与gRNA和Cas9一起递送至细胞,通常在供体质粒或寡核苷酸上。基因敲入的效率通常低于敲除(<10%的修饰等位基因),但可用于产生范围从单核苷酸变化至大插入物的特定修饰。

基因激活和抑制

除了作为基因组编辑工具之外,CRISPR还可以用作其他功能蛋白的靶向递送系统。Cas9的一个独特特征是它能够独立于DNA切割而结合靶DNA,因为这是Cas9机制的两个独立步骤。野生型Cas9具有两个核酸酶结构域:RuvC和HNH。为了在没有切割的情况下实现结合,通过诱导点突变(SpCas9中的D10A和H840A)使两个核酸酶结构域失活,导致核酸酶死亡的Cas9(dCas9)。当与靶向转录起始位点的gRNA组合时,发现单独的dCas9足以通过阻断转录起始来降低或抑制转录。在这一发展之后,科学家开始尝试将转录抑制因子和激活因子与dCas9联系起来。KRAB转录抑制结构域已经与dCas9融合,作为效应结构域介导的转录沉默的模式。dCas9也与转录激活因子和转录效应蛋白融合。用于激活的dCas9是广泛流行的研究领域,并且包括诸如dCas9-VP64、dCas9_SunTag、dCas9-SAM、dCas9-RNA支架和dCas9-VPR的系统。 在我们的产品线中,我们将dCas9与人E1A相关蛋白P300的催化组蛋白乙酰转移酶(HAT)核心结构域融合。当与靶向转录起始位点和增强子区域的gRNA组合时,dCas9-P300指导组蛋白乙酰化,从其异染色状态释放DNA,以通过天然染色体环境中的内源细胞机制上调基因表达。dCas9-P300组蛋白乙酰化方法代表了相对于dCas9-VP64或其他类似基因活化基序的独特作用机制。

筛选

筛选可以快速调查大量候选基因或基因组位点,以参与您的途径或感兴趣的表型。池化寡核苷酸生产和大数据处理的改进,加上慢病毒递送的效率,使研究人员能够同时考虑数千个候选基因,无论是作为文库还是更为集中的子集(panel)。我们将文库定义为CRISPR克隆的全部基因组集合;而子集(panel)则是较小的基因子集。通常,子集(panel)和文库可以以两种形式组装:池化(在一个管中有数千个gRNA)或排列(在96孔板中每个孔一个gRNA)。这两种方法都能快速地为更大的问题提供答案,与过去的方法相比具有明显的优势,过去的老方法需要一次一个地询问候选基因,是一个费时费力的过程。

我们提供多种筛选解决方案,包括来自Broad的池化GeCKO文库,以及Sanger阵列全基因组慢病毒CRISPR文库,以执行大型基因敲除筛选(8)。并且,人类和小鼠CRISPR / Cas9协同激活调控子(SAM)池化文库亦即将推出,用于全基因组筛选转录激活表型!

上海峰志仪器有限公司提供便携式荧光蛋白激发光源LUYOR-3415RG,能够快速筛选荧光蛋白在愈伤、种子、叶片上的表达。现货供应美国路阳、美国nightsea便携式荧光光源,能够筛选绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白等多种荧光蛋白的表达。

CRISPR / CAS9是什么?

CRISPR / Cas9系统于1993年被发现,并且显示在细菌和古细菌生物体内进化,作为对病毒和外来质粒的防御。天然CRISPR途径的功能是将核酸酶靶向侵入性DNA,产生潜在致命的双链断裂(DSB)。在识别该途径的功能后不久,来自细菌化脓性链球菌(SpCas9)的II型CRISPR / Cas9系统被重新利用以产生简单但强大的分子工具,其可被编程以将核酸酶靶向特定的基因组序列。

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